NGS-PrimerPlex
NGS-PrimerPlex suunnittelee alukkeita kohdennetun seuraavan sukupolven sekvensoinnin (NGS) multiplex-PCR-paneeleihin. Se suunnittelee alukeparit kohdealueille, tarkistaa niiden sitoutumisen genomin ei-kohdealueisiin sekä yleiset SNP:t ja jakaa ne multiplex-reaktioihin.
Lisenssi
Vapaasti käytettävissä ja avointa lähdekoodia GNU GPLv3 -lisenssillä.
Saatavuus
- Roihu-CPU: 1.3.4,
bio-apps-moduulin kautta.
Käyttö
NGS-PrimerPlex on osa Roihun bio-apps -kokoelmaa. Lataa ensin bio-apps-moduulipuu ja sitten NGS-PrimerPlex-moduuli:
Roihussa NGS-PrimerPlex on saatavilla vain komentorivityökaluina ilman graafista käyttöliittymää.
Alukkeiden suunnittelu ja genomitarkistukset voivat kestää tunteja, joten suorita NGS-PrimerPlex eräajona, älä kirjautumissolmulla. Katso alla oleva esimerkkieräajokomentosarja.
NGS-PrimerPlex tarvitsee FASTA-muotoisen viitegenomitiedoston. Ei-kohdesitoutumisen tarkistusta varten (-blast, katso alla) viitteen on lisäksi oltava indeksoitu BWA:lla. Katso BWA-indeksit, miten löydät tai luot indeksin.
Kohdealueet annetaan sarkainerotellussa tiedostossa, jossa on yksi alue riviä kohden: kromosomi, aloituskohta, lopetuskohta ja amplikonin nimi. Näiden jälkeen voidaan antaa käytettävät multiplex-reaktiot, alukkeiden tyyppi (L, R tai B vasemmalle, oikealle tai molemmille) sekä W, jos koko alue monistetaan yhtenä amplikonina. Kromosomien nimien on vastattava viite-FASTA-tiedoston nimiä:
Nämä esimerkkikoordinaatit perustuvat ihmisen GRCh38/hg38-viitegenomiin. Varmista, että aluetiedostosi koordinaatit vastaavat viite-FASTA:ssa käytettyä koosteversiota. Myös kaikkien GenBank-annotaatioiden ja dbSNP-tiedostojen on käytettävä samaa koosteversiota.
Voit myös muodostaa aluetiedoston geeniluettelosta komennolla getGeneRegions.py. Tämä tarvitsee hakemiston, jossa on GenBank-tiedosto jokaiselle kromosomille nimettynä viite-FASTA-tiedoston kromosominimen mukaan (esimerkiksi chr1.gb):
Geeniluettelossa on yksi geeni riviä kohden, ja valinnaisesti mukana voivat olla kohdistettavat eksonit tai kodonit. Katso esimerkkigeeniluettelo NGS-PrimerPlexin repositoriosta.
Suunnittele alukkeet; -th määrittää säikeiden määrän (oletus on kaksi):
-blast tarkistaa alukkeiden sitoutumisen genomin ei-kohdealueisiin BWA:lla. Jos haluat lisäksi jättää pois alukkeet, jotka kattavat yleisiä SNP:iä, lisää -snps -dbsnp sekä bgzip-pakattu ja indeksoitu dbSNP VCF -tiedosto viitegenomillesi.
Tulokset kirjoitetaan aluetiedoston viereen. Kunkin multiplex-muunnelman alukkeet ovat tiedostossa genes.regions_primers_combination_<number>_info.xls. Jos joillekin alueille ei voida suunnitella alukkeita, suorita NGS_primerplex.py uudelleen vähemmän tiukoilla parametreilla ja lisää -draft genes.regions_all_draft_primers.xls. Tällöin se suunnittelee alukkeet vain jäljellä oleville alueille.
Jos haluat lisätä adapterisekvenssit suunniteltuihin alukkeisiin, käytä addSeqToPrimers.py-työkalua.
Esimerkkieräajokomentosarja
#!/bin/bash
#SBATCH --job-name=ngs-primerplex
#SBATCH --account=<project>
#SBATCH --output=output_%j.txt
#SBATCH --error=errors_%j.txt
#SBATCH --partition=small
#SBATCH --time=12:00:00
#SBATCH --nodes=1
#SBATCH --ntasks=1
#SBATCH --cpus-per-task=8
#SBATCH --mem=16G
module load bio-apps/v202603
module load ngs-primerplex/1.3.4
NGS_primerplex.py -regions genes.regions.csv -ref genome.fa -blast -th $SLURM_CPUS_PER_TASK
Korvaa <project> omalla CSC-projektillasi (esimerkiksi project_2001234).
Katso eräajokomentosarjan luominen Roihulle saadaksesi lisätietoja eräajojen suorittamisesta.